山茱萸总甙干预骨质疏松模型大鼠骨代谢：TRPV6、TRPV5通路的变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1138

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (11): 1749-1754.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1138

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山茱萸总甙干预骨质疏松模型大鼠骨代谢：TRPV6、TRPV5通路的变化

李绍烁1，赵京涛1，2，何昌强3，孙汉桥4，阮冠龙1

(1广州中医药大学，广东省广州市 510405；2广州中医药大学第一附属医院，广东省广州市 510405；3深圳市罗湖区中医院，广东省深圳市 518021；4湖北省中医院，湖北省武汉市 430061)

收稿日期:2018-10-27 出版日期:2019-04-18 发布日期:2019-04-18
通讯作者: 赵京涛，硕士，副教授，副主任医师，硕士生导师，广州中医药大学，广东省广州市 510405；广州中医药大学第一附属医院，广东省广州市 510405
作者简介:李绍烁，男，1992年生，广东省汕头市人，汉族，广州中医药大学在读硕士，主要从事中医药防治骨伤科疾病的研究工作。
基金资助:
广东省自然科学基金(S2013010012540)，项目负责人：赵京涛

Cornus officinalis glycosides intervening bone metabolism in rat models of osteoporosis: changes of TRPV6 and TRPV5 pathways

Li Shaoshuo1,Zhao Jingtao1,2,He Changqiang3,Sun Hanqiao4,Ruan Guanlong1

(1Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China; 2the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China; 3Shenzhen Luohu District Hospital of Traditional Chinese Medicine, Shenzhen 518021, Guangdong Province, China; 4Hubei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Wuhan 430061, Hubei Province, China)

Received:2018-10-27 Online:2019-04-18 Published:2019-04-18
Contact: Zhao Jingtao, Master, Associate professor, Associate chief physician, Master’s supervisor, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China; the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China
About author:Li Shaoshuo, Master candidate, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. S2013010012540 (to ZJT)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
TRPV6和TRPV5：作为瞬时性受体电位通道(TRP)超家族中目前已知仅有的高选择性钙离子通道，通过免疫组织化学、Western-blot、RT-PCR等技术已发现，包括人与鼠类、兔等哺乳动物的一些具有钙离子跨膜转运功能的组织器官(如小肠、骨组织、肾脏等)，都存在TRPV6和TRPV5通道蛋白，而雌激素、甲状旁腺激素、1，25-(OH)2D3等多种因素通过对TRPV6和TRPV5通路表达进行调节，从而影响组织的钙离子代谢。
山茱萸：学名Cornus officinalis Sieb.et Zucc.，产自中国山西、陕西、甘肃、山东、江苏、浙江、安徽、江西、河南、湖南等省，朝鲜、日本也有分布。生于海拔400-1 500 m，稀达2 100 m的林缘或森林中。在四川有引种栽培。该种(包括川鄂山茱萸)的果实称“萸肉”，俗名枣皮，供药用，味酸涩，性微温，为收敛性强壮药，有补肝肾止汗的功效。

摘要
背景：钙离子通道的调控直接影响骨的代谢，但骨代谢与TRPV6、TRPV5通路的联系及相互作用目前尚未明确。研究认为山茱萸具有防治骨质疏松作用。
目的：探讨山茱萸总甙调节TRPV6、TRPV5通路表达防治骨质疏松症的机制。
方法：健康6月龄雌性SD大鼠50只，体质量(350±15) g，由广州中医药大学实验动物中心提供。随机将大鼠分为5组，即正常对照组，模型组，山茱萸总甙干预低剂量组、中剂量组及高剂量组。除正常对照组外，其余各组大鼠行双侧卵巢切除术建立骨质疏松模型。造模后山茱萸总甙干预各组依剂量每天予药物灌胃，正常对照组及模型组予等量生理盐水灌胃，共12周。实验结束时，双能X射线骨密度仪扫描各组大鼠获取骨密度，取右侧股骨组织RT-PCR检测TRPV6、TRPV5 RNA基因表达情况。
结果与结论：①山茱萸干预各组大鼠骨密度均较模型组提高(P < 0.05)；②各组大鼠骨组织均有TRPV6、TRPV5表达，其中山茱萸总甙干预各组TRPV6、TRPV5表达均较正常对照组及模型组增加，以中剂量组表达升高最明显，但高剂量组TRPV6/TRPV5倍比关系为最高，成骨效能最好；③结果说明，山茱萸总甙可调节骨质疏松大鼠骨组织TRPV6、TRPV5通道蛋白表达，改变TRPV6/TRPV5倍比关系，影响成骨细胞和破骨细胞功能，促进成骨方向的骨代谢转变及提高骨密度。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-0247-9863(李绍烁)

关键词: 骨质疏松, 山茱萸总甙, TRPV6, TRPV5, 钙离子通道, 骨代谢, 成骨转化, 成骨功能, 骨密度

Abstract:

BACKGROUND: Regulation of calcium channel directly affects bone metabolism, but the correlation of bone metabolism with TRPV6/TRPV5 pathways remains unclear. Cornus officinalis has been shown to treat and prevent osteoporosis.
OBJECTIVE: To explore the mechanism of Cornus officinalis glycosides underlying intervening the expression of TRPV6 and TRPV5 for preventing and treating osteoporosis.
METHODS: Fifty healthy 6-month-old male Sprague-Dawley rats (provide by Lanoratory Animal Center of Guangzhou University of Chiense Medicine) were selected, weighting (350±15) g. The rats were randomly divided into control (normal saline treatment), model (normal saline treatment), low-, medium, and high-dose Cornus officinalis glycosides groups. The model of osteoporosis was established by bilateral ovariectomy in the latter four groups. The administration was given gastricly, and for 12 weeks. At the end of the experiment, the bone mineral density was detected by dual energy X-ray absorptiometry. The expression levels of TRPV6 and TRPV5 in the right femur were detected by RT-PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: The bone mineral density in the Cornus officinalis glycosides groups was significantly higher than that in the model group (P < 0.05). TRPV6 and TRPV5 were expressed in bone tissues of rats in each group. The expression levels of TRPV6 and TRPV5 in all the Cornus officinalis glycosides groups were higher than those in the control and model groups. The medium dose group had the highest expression levels of TRPV6 and TRPV5. The ratio of TRPV6 to TRPV5 and osteogenesis performance in the high-dose group was highest. These results imply that Cornus officinalis glycosides can promote the expression of TRPV6 and TRPV5 in bone tissue of osteoporotic rats, change the ratio of TRPV6 to TRPV5, affect the function of osteoblasts and osteoclasts, promote osteogenesis and improve bone mineral density.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Cornus, Osteoporosis, Calcium Channels, Tissue Engineering

中图分类号:

R446

李绍烁, 赵京涛, 何昌强, 孙汉桥, 阮冠龙. 山茱萸总甙干预骨质疏松模型大鼠骨代谢：TRPV6、TRPV5通路的变化[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(11): 1749-1754.

Li Shaoshuo, Zhao Jingtao, He Changqiang, Sun Hanqiao, Ruan Guanlong. Cornus officinalis glycosides intervening bone metabolism in rat models of osteoporosis: changes of TRPV6 and TRPV5 pathways[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(11): 1749-1754.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析实验选用大鼠50只，分为5组，实验过程中无脱失，全部进入结果分析。

2.2 各组一般情况实验开始，各组大鼠精神状态、活动、进食均良好。实验过程中正常对照组大鼠精神状态、行为活动、毛色等均保持正常。余各组动物行双侧卵巢切除术后均出现精神状态抑制、活动减少表现，其中模型组大鼠表现最明显；山茱萸总甙干预各组大鼠，随药物浓度增加，相应症状缓解。实验结束，各组大鼠平均体质量呈不同程度增加，大鼠体质量增加幅度：正常对照组 < 山茱萸总甙干预高剂量组 < 山茱萸总甙干预中剂量组 < 山茱萸总甙干预低剂量组 < 模型组。

2.3 各组大鼠骨密度结果见表2。正常对照组大鼠骨密度为各组最高，骨质疏松模型组及山茱萸总甙干预各组大鼠骨密度下降，其中模型组骨密度最低，山茱萸总甙干预各组大鼠骨密度较模型组升高，且随药物剂量升高骨密度升高。正常对照组及山茱萸总甙干预各组与模型组比较，差异有显著性意义(P < 0.05)；山茱萸总甙干预中、高剂量组与低剂量组比较，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.4 骨组织TRPV6、TRPV5基因表达情况见表3，各组大鼠骨组织中TRPV6和TRPV5基因均有表达。模型组大鼠TRPV5基因表达较正常对照组增加，但差异无显著性意义(P=0.786)；模型组大鼠TRPV6基因表达较正常对照组减少，差异无显著性意义(P=0.975)。山茱萸总甙干预各组大鼠TRPV6、TRPV5基因表达，均较模型组与正常对照组增加，差异有显著性意义(P < 0.05)；中剂量组的TRPV6、TRPV5基因表达高于低剂量组及高剂量组；山茱萸总甙干预各组TRPV6/TRPV5倍比关系较正常对照组与模型组升高，其中以高剂量组TRPV6/TRPV5倍比最高，见图1，2。

参考文献

[1] 原发性骨质疏松症诊疗指南(2017) [J].中国实用内科杂志, 2018, 38(2):127-150.

[2] CLAPHAM DE. TRP channels as cellular sensors. Nature. 2003; 426(6966):517-524.

[3] Montell C, Birnbaumer L, Flockerzi V, et al. A unified nomenclature for the superfamily of TRP cation channels. Molecular Cell.2002;9(2): 229-231.

[4] Shi DJ, Wang KW. The progress of TRP channels in structural studies. Sheng Li Ke Xue Jin Zhan. 2014;45(6):401-409.

[5] Hoenderop JG, Nilius B, Bindels RJ. Molecular mechanism of active Ca2+ reabsorption in the distal nephron. Annu Rev Physiol. 2002;64:529-549.

[6] Hoenderop JG, Vennekens R, Müller D, et al. Function and expression of the epithelial Ca(2+) channel family: comparison of mammalian ECaC1 and 2. J Physiol. 2001;537(Pt 3):747-761.

[7] Müller D, Hoenderop JG, Meij IC, et al. Molecular cloning, tissue distribution, and chromosomal mapping of the human epithelial Ca2+ channel (ECAC1). Genomics. 2000;67(1):48-53.

[8] Peng JB, Chen XZ, Berger UV, et al. Human calcium transport protein CaT1. Biochem Biophys Res Commun. 2000;278(2): 326-332.

[9] van de Graaf SF, Boullart I, Hoenderop JG, et al. Regulation of the epithelial Ca2+ channels TRPV5 and TRPV6 by 1alpha, 25-dihydroxy Vitamin D3 and dietary Ca2+ J Steroid Biochem Mol Biol. 2004;89-90(1-5):303-308.

[10] KIM M H, LEE G S, JUNG E M, et al. The negative effect of dexamethasone on calcium-processing gene expressions is associated with a glucocorticoid-induced calcium-absorbing disorder. Life Sci. 2009;85(3-4):146-152.

[11] Van Cromphaut SJ, Stockmans I, Torrekens S, et al. Duodenal calcium absorption in dexamethasone-treated mice: functional and molecular aspects. Arch Biochem Biophys.2007;460(2): 300-305.

[12] Weber K, Erben RG, Rump A,et al. Gene structure and regulation of the murine epithelial calcium channels ECaC1 and 2. Biochem Biophys Res Commun.2001;289(5):1287-1294..

[13] 郭清河,叶添文.TRPV5/TRPV6调节骨代谢作用的研究进展[J].中国矫形外科杂志,2011,19(23):1976-1978.

[14] 周京华,李春生,李电东.山茱萸有效化学成分的研究进展[J].中国新药杂志,2001,10(11):808-812.

[15] 李晶.针灸及山茱萸总甙对去势大鼠骨代谢影响的生化研究[D].天津:天津中医学院,2004.

[16] Diederichs S, Freiberger F, van Griensven M. Effects of repetitive and short time strain in human bone marrow stromal cells. Journal of biomedical materials research Part A.2009;88(4):907-915.

[17] Hoenderop JG, van Leeuwen JP, van der Eerden BC, et al. Renal Ca2+ wasting, hyperabsorption, and reduced bone thickness in mice lacking TRPV5. J Clin Invest. 2003;112(12):1906-1914.

[18] van der Eerden BC, Hoenderop JG, de Vries TJ, et al. The epithelial Ca2+ channel TRPV5 is essential for proper osteoclastic bone resorption. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005; 102(48): 17507-17512.

[19] 车明学,谷贵山,李福春.新型钙离子通道TRPV5在骨质疏松症发病机制中的作用[J].中国老年学杂志,2007,27(17):1732-1734.

[20] Walters JR, Balesaria S, Chavele KM,et al. Calcium channel TRPV6 expression in human duodenum: different relationships to the vitamin D system and aging in men and women. J Bone Miner Res. 2006;21(11):1770-1777.

[21] Barthel TK, Mathern DR, Whitfield GK, et al. 1, 25-Dihydroxyvitamin D3/VDR-mediated induction of FGF23 as well as transcriptional control of other bone anabolic and catabolic genes that orchestrate the regulation of phosphate and calcium mineral metabolism. J Steroid Biochem Mol Biol.2007;103(3-5): 381-388.

[22] 李福春.TRPV5/TRPV6对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化及成骨细胞信号传递的影响[D].长春:吉林大学,2008.

[23] 那键.雌激素、维生素D_3对雌性大鼠成骨细胞增殖及钙通道TRPV5/TRPV6表达的影响[D]. 长春:吉林大学,2009.

[24] 叶贤胜.中药山茱萸的化学成分和生物活性研究[D].北京:北京中医药大学,2017.

[25] 郭富礼,张振凌,王洪波.不同山茱萸炮制品中熊果酸含量的比较 [J].时珍国医国药,2002,13(7):404-405.

[26] 刘洪,许惠琴.山茱萸及其主要成分的药理学研究进展[J].南京中医药大学学报(自然科学版) ,2003,19(4):254-256.

[27] 张兰桐,任雷鸣,温进坤.山茱萸提取液抗心律失常有效部位的研究[J].中草药,2001,32(11):47-50.

[28] 刘倩,范颖,姜开运,等山茱萸潜在功能的发掘与利用[J].时珍国医国药,2015,26(11):2764-5.

[29] 陈涛.山茱萸水提液对骨质疏松模型小鼠骨形态学影响[J].天津药学, 2003,15(4):5-6+32.

[30] 李平,李晶,王惠明.山茱萸总苷对去势大鼠骨代谢和骨密度影响的实验研究[J].天津中医药,2007,24(4):315-317.

[31] 李晶,王惠明,李平.山茱萸总苷对去势大鼠骨代谢影响的生化研究[J].辽宁中医杂志,2007,34(10):1480-1482.

[32] 李晶,武峻艳,王慧明,等.山茱萸总苷对去势大鼠骨组织形态学影响的实验研究[J].上海中医药杂志,2010,44(1):69-72.

[33] 王艳,宋春静,孙秀岩,等.山茱萸总苷及其含药血清对MSCs增殖的影响[J].天津中医药大学学报,2013,32(2):101-104.

[34] 章晓云,夏天,陈跃平,等.Zip1转染骨髓间充质干细胞对Wnt1/β- catenin信号成骨通路的影响[J].中国骨质疏松杂志, 2018,24(5): 594-599.

[35] 李庆帆,王佐林.ALP、Runx2及OCN在大鼠拔牙后牙槽骨来源BMSCs中的表达[J].口腔颌面外科杂志,2017,27(2):77-82.

[36] Saville PD, Lieber CS. Effect of alcohol on growth, bone density and muscle magnesium in the rat. J Nutr.1965;87(4):477-484.

[37] 翁世芳,黄克,王洪复.大鼠骨密度测定在骨质疏松模型研制中的应用[C].西安:proceedings of the 第三届全国骨质疏松研讨会, 1994.

[38] 周丽,邓伟民.去势雌性大鼠动物模型在绝经后骨质疏松症中的应用[J].中国组织工程研究与临床康复,2008,12(7):1323-1326.

[39] Rodgers JB, Monier-Faugere MC, Malluche H. Animal models for the study of bone loss after cessation of ovarian function. Bone. 1993;14(3):369-377.

[40] Hellwig N, Albrecht N, Harteneck C, et al. Homo- and heteromeric assembly of TRPV channel subunits. J Cell Sci. 2005;118(Pt 5): 917-928.

[41] Nilius B, Prenen J, Hoenderop JG, et al. Fast and slow inactivation kinetics of the Ca2+ channels ECaC1 and ECaC2 (TRPV5 and TRPV6). Role of the intracellular loop located between transmembrane segments 2 and 3. J Biol Chem.2002; 277(34):30852-30858.

[42] Vennekens R, Hoenderop JG, Prenen J, et al. Permeation and gating properties of the novel epithelial Ca(2+) channel. J Biol Chem.2000;275(6):3963-3969.

[43] Sternfeld L, Anderie I, Schmid A, et al. Identification of tyrosines in the putative regulatory site of the Ca2+ channel TRPV6 . Cell calcium.2007;42(1):91-102.

[44] Zheng W, Hu R, Cai R, et al. Identification and characterization of hydrophobic gate residues in TRP channels. FASEB J. 2018; 32(2):639-653.

[45] Xie H, Cui Z, Wang L, et al. PDGF-BB secreted by preosteoclasts induces angiogenesis during coupling with osteogenesis. Nat Med. 2014;20(11):1270-1278.

引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2015年2月至5月在广州中医药大学完成。

1.3 材料

实验动物：选取健康雌性SD大鼠50只，6月龄，体质量(350±15) g，由广州中医药大学实验动物中心提供，许可证号:SCXK(粤)2013-0020。

药物：山茱萸由广州中医药大学提供。煎取山茱萸原液水浴加热浓缩为0.5 g/mL，依据实验要求，将浓缩液配制成低、中、高浓度山茱萸总甙水提取液。成人使用量为12 g/d(参考《中华人民共和国药典》)，根据Meeh-Rubner 公式，以人与大鼠体表面积比折算成大鼠等效剂量，约2 g/(kg·d)。每周称量大鼠体质量，依体质量变化调整药物浓度。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组及造模随机分为5组，每组10只：①正常对照组；②骨折疏松模型组；③山茱萸总甙干预低剂量组；④山茱萸总甙干预中剂量组；⑤山茱萸总甙干预高剂量组。

除正常对照组外，山茱萸总甙干预各组及模型组大鼠术前均禁饮禁食6 h，腹腔注射体积分数10%水合氯醛溶液3 mL/kg，麻醉15-20 min后取仰卧位固定，行双侧卵巢切除术，建立骨质疏松模型，造模后逐层缝合伤口，碘伏消毒术口，腹腔注射青霉素G 5×10⁴U预防感染。动物苏醒后单笼饲养，造模后3 d内每天注射青霉素G 5×10⁴U，造模后7 d内密切观察大鼠精神状态，伤口及进食情况。

造模后第8天开始，山茱萸总甙干预低、中、高剂量组每天给予山茱萸总甙水提取液5 mL灌胃1次，浓度分别约相当于生药量1 g/kg(0.5倍等效剂量)、2 g/kg(1倍等效剂量)、5 g/kg(2.5倍等效剂量)；每天给予对照组及模型组大鼠等体积的生理盐水灌胃处理1次，共12周。

1.4.2 组织取材及数据采集药物干预12周后，大鼠以体积10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉后，使用双能X射线骨密度仪(美国通用公司)行全身扫描，记录大鼠骨密度数据；扫描完毕，以腹主动脉放血处死大鼠，即刻游离大鼠右侧股骨，存于冻存管中，经液氮冷冻(-192 ℃)，再于超低温冰箱(-80 ℃)中封存备用。

1.4.3 RT-PCR检测 RNA的提取按照TRIozol RNA提取试剂盒(Life Technology公司提供)的使用说明进行，具体引物设计见表1。将大鼠股骨骨组织磨碎置于液氮中，取1 mL TRIzol试剂加入100 mg骨组织，按步骤加入0.2 mL氯仿后离心获得溶解在水相中的RNA，加入500 μL异丙醇，-20 ℃静置1 h后4 ℃离心获得RNA沉淀，加入1 mL体积分数75%乙醇再次离心，将样品于超净工作台上吹干，加入适量DEPC水溶解RNA。用紫外分光光度仪检测RNA纯度符合标准后行下一步实验。于gDNA吸附柱加入RNA并于室温下离心，滤液即消除基因组DNA的目标RNA。RNA热变性(65 ℃)5 min，冰中冷却后保存于-20 ℃。分别取样内参及目的基因组cDNA样本，于荧光定量PCR仪反应， 20 μL的反应体系，样本均行3个平行实验，实验结束，行2^-^??Ct法分析，获取所有样本目的基因相对表达量。

表1 RT-PCR引物

Table 1 Primer for RT-PCR

基因	基因库ID	引物序列		扩增长度(bp)
Rat-βactin	NM_031 144.3	正向	ACC CGC GAG TAC AAC CTT CTT	76
		反向	TAT CGT CAT CCA TGG CGA ACT	76
Rat-TRPV5	NM_053 787.2	正向	CAT ACT CCA CAC CCT TCT CTC ATC	91
		反向	TTC CCA GAC CTT ACT TAT TTC TTT GC	91
Rat-TRPV6	NM_053 686.1	正向	CTG CTG GCT GAT GGC TGT G	144
		反向	TGA TGG TGA GGA AGA GTT CAA AGG	144

1.5 主要观察指标 ①大鼠骨密度；②骨组织TRPV6、TRPV5 mRNA表达。

1.6 统计学分析使用SPSS 24.0统计软件行数据分析，用x(_)±s表示计量资料；完全随机设计的计量资料，其组间比较行单因素方差分析。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

3.1 TRPV6、TRPV5与骨代谢作为瞬时性受体电位通道(TRP)超家族中目前已知仅有的高选择性钙离子通道，通过免疫组织化学、Western-blot、RT-PCR等技术已发现，包括人与鼠类、兔等哺乳动物的一些具有钙离子跨膜转运功能的组织器官(如小肠、骨组织、肾脏等)，都存在TRPV6和TRPV5通道蛋白，而雌激素、甲状旁腺激素、1，25-(OH)2D3等多种因素通过对TRPV6和TRPV5通路表达进行调节，从而影响组织的钙离子代谢。

骨代谢过程，包括成骨细胞分化，以及骨形成、吸收、破坏等，与骨组织中钙离子在细胞内外的转运密切相关，钙离子通道的调控直接影响骨的代谢^[16]，但骨代谢与TRPV6、TRPV5通路的联系及相互作用目前尚未明确。

Hoenderop等^[17]研究发现TRPV5在人和鼠类破骨细胞表达，在破骨细胞吸收面的微绒毛所形成的毛刷状缘存在TRPV5蛋白优势表达；在(TRPV5+/+)大鼠胫骨皮质接种破骨细胞后，切片可见明显骨吸收陷窝，在(TRPV5-/-)大鼠中则不明显^[18]。车明学等^[19]据此推测TRPV5可能有促进骨吸收的作用，缺乏TRPV5可能使破骨细胞出现代偿性的数量增多及体积增大，即功能缺陷代偿。Van der Eerden等^[18]应用RT-PCR 技术在人和鼠类成骨细胞中没有检测到TRPV5 mRNA表达，但存在TRPV6 mRNA；TRPV6敲除鼠的股骨骨密度下降，发生骨质疏松^[20]；Barthel等^[21]研究发现，维生素D通过诱导TRPV6、FGF23及Runx2等基因的转录和表达，从而调节钙和磷的矿物质代谢，提示TRPV6通道可能调控骨形成/矿化过程。

李福春等^[22]在大鼠骨髓间充质细胞分化为成骨细胞的过程中，发现成骨细胞中TRPV6和TRPV5通道出现程度不同阳性表达。伴随诱导分化时间延长，其表达逐渐增强。应用1，25-(OH)2D3、TRPV5和TRPV6通道阻滞剂CuCl₂进行干预后，发现有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)和核因子κB受体激活剂配体(receptor activator of nuclear factor-κb ligand，RANKL)mRNA表达，随TRPV6和TRPV5 mRNA的表达而改变，认为TRPV6、TRPV5钙离子通道改变成骨细胞内钙离子含量的变化，进而调节成骨细胞的MAPK及RANK信号通路传导，调节成骨细胞增殖能力及骨代谢功能。那健等^[23]通过去势大鼠体内实验证明：雌激素促进TRPV6通道表达，刺激骨保护蛋白、RANKL的表达通路，以此介导成骨细胞增生；在体外成骨细胞培养实验中，雌激素诱导成骨细胞的骨保护蛋白、TRPV6、TRPV5 mRNA与蛋白质表达呈现剂量依赖性。

高选择性钙离子通道TRPV6和TRPV5，被认为可能是调节破骨细胞、成骨细胞生物学功能新兴靶点。通过调节TRPV6、TRPV5钙离子通道的状态，进而改变成骨细胞、破骨细胞的增殖分化行为，最终改善机体骨代谢状况，可能是临床治疗骨质疏松症等骨代谢疾病的新探索。

3.2 山茱萸总甙对骨质疏松模型大鼠骨密度的影响自古以来，补肾法便被视为治疗“骨萎”的基本治法，补充肾之阴阳精气的虚少，防治骨质疏松。中药山茱萸，味酸涩，性微温，归肝肾经，有补益肝肾，收涩固脱的功效，主治腰膝酸痛、眩晕耳鸣、遗尿尿频、阳痿遗精、崩漏带下、大汗虚脱、内热消渴等症^[24]。以腰膝酸痛、全身关节痹痛、驼背等为主要表现之“骨萎”、“骨痹”，即现代医学之骨质疏松症，正是山茱萸治疗的主治症。现代药理研究发现，山茱萸总甙的主要有效成分环烯醚甙类，具有增强免疫、降血糖、利尿降压、抗炎等作用^[25-27]。亦有研究指出，除了《药典》记载的功效外，山茱萸尚有祛风散寒除湿、安神、调经、行气活血等潜在功效值得发掘利用^[28]。陈涛等^[29]以山茱萸水提取液干预SAMP6小鼠，发现干预组小鼠在骨皮质厚度、骨细胞数目、骨小梁面积等骨形态指标均有提高，认为山茱萸具有防治骨质疏松作用。

在现代医学研究中，有研究者认为中医“肾虚”者类似于下丘脑-垂体-性腺轴功能减退，性激素分泌不足，成骨功能减退，骨量减少终致骨质疏松。李平等^[30]研究发现山茱萸总甙可提高去势大鼠雌激素，具有拟雌激素作用；李晶，王惠明等^[31-32]通过使用山茱萸总甙干预去势大鼠研究，发现干预组大鼠血碱性磷酸酶、骨钙素等成骨指标得到提高，骨吸收指标脱氧吡啶啉(DPD)有所下降，骨生物力学、骨组织形态、骨密度等指标呈现向成骨方向转变。王艳等^[33]研究证实山茱萸总甙及其含药血清可促进大鼠骨髓间充质细胞增殖。另有研究认为通过对Wnt1/β-catenin 信号成骨通路的刺激作用，可诱导骨髓间充质细胞成骨分化^[34]。q-PCR检测可发现其成骨指标碱性磷酸酶、骨钙素及核心结合因子(Runt-related transcription factor 2，Runx2)的mRNA表达增加，茜素红染色形成明显钙结节^[35]。山茱萸总甙可能参与调控Wnt1/β-catenin 信号通路，促进成骨，以防治骨质疏松。

研究选取6月龄健康雌性大鼠，摘除双侧卵巢。建立绝经后骨质疏松经典模型^[36-37]，模拟其骨代谢的特点^[38]，雌激素减少的骨行为与骨量减少，接近于自然绝经后的女性，此模型方便实用^[39]。由研究结果可知，同等饲养条件下，山茱萸总甙干预的各组大鼠，骨密度水平均高于骨质疏松模型组，且随给药剂量的增加其升高骨密度的作用越趋明显，证明山茱萸总甙对防治大鼠骨质疏松症有明确疗效，但山茱萸总甙干预各组大鼠骨密度较正常对照组为低(P < 0.05)，提示山茱萸总甙尚不能完全逆转去势大鼠骨密度的下降。

3.3 山茱萸总甙对骨质疏松大鼠TRPV6、TRPV5的影响研究基于TRPV6、TRPV5钙离子信号通道水平探讨山茱萸总甙对大鼠骨质疏松模型的影响。结果显示，TRPV6和TRPV5 mRNA在所有大鼠的骨组织中均有表达，模型组大鼠TRPV5 mRNA表达较正常对照组升高，TRPV6 mRNA表达低于正常对照组，这与国内外相关研究一致，去势大鼠破骨细胞TRPV5 mRNA表达增加，成骨细胞TRPV6 mRNA表达减弱，骨代谢平衡朝骨破坏吸收方向发展，结合骨密度检测结果可证实。

山茱萸总甙干预各组大鼠骨组织TRPV6、TRPV5表达较正常对照组及骨质疏松模型组明显升高，差异具有统计学意义。低、中剂量山茱萸总甙干预下大鼠骨组织TRPV6、TRPV5表达随药物剂量升高而升高，高剂量干预下TRPV6、TRPV5表达有所下降，其作用存在一定药物剂量浓度依赖性。山茱萸总甙提高TRPV5表达，增强破骨细胞骨吸收重建活动；同时促使TRPV6以更高的水平表达，提高成骨细胞增殖、分化，骨改建过程中陈旧破损的骨质被破骨细胞吸收，并释放趋化因子聚集成骨细胞产生新的骨质，并分化为骨细胞，使骨重建向成骨方向转变，防治骨质疏松。

从TRPV6与TRPV5基因表达的倍比关系来看，模型组较正常对照组为低，TRPV5表达比例增加，骨代谢以破骨方向发展为主；山茱萸总甙干预各组TRPV6/TRPV5均高于模型组及正常对照组，结合骨密度及TRPV6、TRPV5基因表达具体数值来看，药物干预各组可能通过调节TRPV6、TRPV5通道表达，进一步调节成骨细胞、破骨细胞的细胞增殖分化过程，使骨重建向成骨方向发展。同时也发现，药物干预各组中，高剂量干预组TRPV6/TRPV5倍比关系为最高，其次是低剂量组，中等剂量组为最低。而骨密度数值以高剂量组最高，TRPV6、TRPV5基因表达数值则是中剂量组最高。TRPV6、TRPV5基因表达活性可能与山茱萸总甙剂量浓度存在一定依赖关系，有最佳浓度水平促进其基因的最大量表达；同时不同浓度药物干预，使TRPV6、TRPV5表达倍比关系不同，可能引起TRPV6、TRPV5通道蛋白构型、电生理水平的不同改变，激活下游不同的通路，有不同的成骨效能。TRPV6/TRPV5基因表达倍比关系越高，其成骨效能可能更好。

Hellwig等^[40]研究证明TRPV6和TRPV5 似乎是唯一形成异四倍体的钙离子通道，组织中对 TRPV6和TRPV5相对表达量的调节有可能是精细调节钙转运动力学的机制。电生理研究分析表明；活动性TRPV6、TRPV5通道在有电流通过时，存在生物膜电位改变，受钙离子反馈调节，包括快速失活和缓慢衰退的过程^[41-42]。其特征性标志是包含一个几乎完全的内向整流。Sternfeld等^[43]研究表明HEK293细胞中，钙离子转运在TRPV6、TRPV5介导下表现出特殊电生理学特征：依赖性Ca²⁺通道失活和依赖于Ca²⁺内流的细胞超极化。Zheng等^[44]发现TRPV通道在不同活性下表现出不同蛋白构型。在骨重建过程中，有研究者提出破骨前体细胞分泌的血小板源性生长因子BB所诱导的CD31hiEmcnhi血管与成骨细胞、破骨细胞等同样重要，三者共同构成了骨重建的三元调控机制^[45]。

相关TRPV6、TRPV5的蛋白组学、电生理等研究以及骨重建等前沿研究提示，山茱萸总甙通过调节TRPV6、TRPV5通路改善骨代谢、治疗骨质疏松症可能存在许多未知的变化，需要进一步行相关实验研究探索其机制。

3.4 研究创新与不足研究基于TRPV6、TRPV5高选择性钙离子通道水平探讨传统补肾中药山茱萸有效成分——山茱萸总甙对骨质疏松大鼠骨密度及相关通道基因表达的影响，从微观分子水平研究山茱萸治疗骨质疏松症的机制，为临床中医药治疗骨质疏松症提供线索，具有一定创新性。但是由于人手、经费、时间等客观因素限制，研究未对山茱萸总甙干预骨质疏松模型大鼠进行TRPV6、TRPV5的相关免疫组织化学、蛋白表达、电生理水平以及骨生物力学等方面研究，对于山茱萸总甙调节骨组织TRPV6、TRPV5从而防治骨质疏松症的机制尚不能完全明确。希望本研究后期能通过Western-blot、免疫荧光、相关血管显像等技术进一步研究，明确经典补肾中药山茱萸防治骨质疏松症的作用机制，为其临床使用提供证据。

结论：山茱萸总甙通过调节骨组织TRPV6、TRPV5通路蛋白表达，提高TRPV6、TRPV5基因表达倍比关系，影响成骨细胞和破骨细胞活性，使骨重建中成骨功能高于破骨功能，促进成骨方向的骨代谢转变，提高骨密度，防治骨质疏松。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

山茱萸总甙干预骨质疏松模型大鼠骨代谢：TRPV6、TRPV5通路的变化

Cornus officinalis glycosides intervening bone metabolism in rat models of osteoporosis: changes of TRPV6 and TRPV5 pathways

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[1]	安杨 , 廖艺楠 , 谢程欣 , 李清龙 , 黄戈 , 金鑫 , 尹东 . 中药旋覆花治疗骨质疏松症作用机制的网络药理学分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-8.
[2]	唐辉, 姚志浩, 罗道文, 彭双麟, 杨双林, 王浪, 肖金刚. 高脂高糖饮食结合链脲佐菌素建立2型糖尿病性骨质疏松症大鼠模型[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1207-1211.
[3]	陈继铭, 吴晓静, 刘田丰, 陈海聪, 黄成硕. 水飞蓟素对四氯化碳致小鼠肝损伤和骨代谢的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1224-1228.
[4]	李中峰, 陈明海, 凡一诺, 魏秋实, 何伟, 陈镇秋. 右归饮治疗激素性股骨头坏死作用机制的网络药理学分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1256-1263.
[5]	侯广原, 张继学, 张志军, 孟祥晖, 段文, 高维陆. 骨水泥强化椎弓根螺钉内固定治疗伴骨质疏松腰椎退行性疾病的1年随访[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(6): 878-883.
[6]	杨卫强, 丁童, 杨卫可, 蒋振刚. 组合式可变应力接骨板内固定干预山羊股骨骨折断端的骨组织细胞功能及骨密度变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(6): 890-894.
[7]	李时斌, 赖渝, 周毅, 廖建钊, 章晓云, 张璇. 激素性股骨头坏死发病机制及相关信号通路的靶点效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(6): 935-941.
[8]	郑小龙, 何晓铭, 龚水帝, 庞凤祥, 杨帆, 何伟, 刘少军, 魏秋实. 酒精性股骨头坏死患者的骨转换特点[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 657-661.
[9]	肖方骏, 陈树东, 栾继耀, 侯宇, 何坤, 林定坤. 丹参干预骨质疏松症：网络药理学解释的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 772-778.
[10]	刘波, 陈祥和, 杨康, 余慧琳, 陆鹏程. DNA甲基化在运动干预骨质疏松中的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 791-797.
[11]	聂少波, 李建涛, 孙基恩, 赵喆, 赵燕鹏, 张里程, 唐佩福. 内侧支撑髓内钉置入支撑治疗严重骨质疏松性股骨转子间骨折的力学稳定性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(3): 329-333.
[12]	钟远鸣, 万通, 钟锡锋, 吴卓檀, 何炳坤, 吴思贤. 弯角与单侧椎弓根入路椎体成形治疗骨质疏松性椎体压缩骨折有效性与安全性的Meta分析 [J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(3): 456-462.
[13]	潘东续, 杨靖, 李耀华, 刘玉章, 段永刚, 钟蔼云, 唐晓龙, 丁英奇. 肱骨近端锁定钢板结合同种异体骨移植增强固定治疗肱骨近端骨质疏松骨折[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(27): 4368-4373.
[14]	游斌, 黄秀珠, 林煜, 黄浠. 自然衰老大鼠不同部位骨组织形态、骨密度及骨代谢指标的变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(26): 4118-4122.
[15]	朱云, 陈渝, 邱皓, 刘盾, 靳国荣, 陈诗谋, 翁政. 对侧皮质锁定螺钉治疗骨质疏松股骨骨折的有限元分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(24): 3832-3837.